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Nomenclatura dos vetores pCAMBIA herdados O sistema de numeração de quatro dígitos funciona da seguinte maneira: Primeiro dígito - indica a seleção da planta: 0 para a ausência 1 para a resistência à higromicina 2 para a canamicina e 3 para a fosfinotricina (os vetores contendo o gene de resistência à fosfinotricina não estão mais disponíveis na CAMBIA em O pedido da Bayer, que possui patentes que restringem a sua utilização em alguns países). Segundo dígito - indica selecção bacteriana: 1 para espectinomicina / resistência a estreptomicina 2 para cloranfenicol 3 para canamicina 4 para espec / strep e canamicina. Terceiro dígito - indica o poliligador utilizado: 0 para o poliligador 8 de pUC18 para o poliligador 9 de pUC8 para o poliligante pUC9. Quarto dígito - indica o (s) gene (s) repórter (s) presente (s): 0 para nenhum gene repórter 1 para E. coli gusA2 para mgfp 5 3 para gusA: mgfp 5 fusão 4 para mgfp5: gusA fusão 5 para Staphylococcus sp. GusA (GUSPlus). Quinto dígito - nota alguma outra característica especial. Até agora isto tem sido utilizado apenas com: pCAMBIA1305.1 e plasmídeos derivados dele, onde o .1 denota a ausência de um péptido sinal da proteína GUSPlustrade e pCAMBIA1305.2 onde o .2 denota a presença do péptido sinal GRP para In planta secreção da proteína GUSPlustrade. A letra retardada X indica que o gene repórter carece de seu próprio codão de iniciação e o vetor é para criar fusões para o repórter Z indica a presença de uma lacZa funcional para a seleção azul-branca a / b / c indica o quadro de leitura para fusões com o fusível E Usar vetores. Notas Devido às limitações de recursos, nem todas as combinações de características vetoriais possíveis foram criadas em CAMBIA. Você pode inicialmente ficar desapontado ao descobrir que nós não temos, por exemplo, um pCAMBIA2205.2. Os vetores foram projetados contudo, de modo que deveria ser uma questão relativamente simples para um pesquisador que necessitar desse vetor para construí-la a partir dos componentes em outros vetores. Se você criou um derivado vetorial pCAMBIA que outros pesquisadores acharão útil, entre em contato conosco. Vector Manual Adenda: Nota importante para os usuários pCAMBIA (clicando em um número de plasmídeo irá navegar para o arquivo Genbank) Seleção de Plantas Gene Seleção de Bactérias Gene Frame de Leitura ou lacZ Comentários Ocultar Não existem comentários. Por favor, faça o login para poder adicionar comentários. pCambia Vectors Informações sobre os nossos mais recentes vetores, que contêm GUSPlustrade, podem ser encontrados no BioForge. Enquanto Cambia não está mais distribuindo esses vetores, você ainda pode solicitá-los de qualquer outro laboratório que usa ou publica usando-os (eles estavam disponíveis sob os termos de código aberto de uma licença BiOS (info)) Muitas das informações abaixo referem-se a pCAMBIA mais antiga Vectores A transformação das plantas é agora rotina em centenas de laboratórios em todo o mundo, utilizando métodos de transferência de ADN mediada por bactérias ou directos, tais como bombardeamento. Esses métodos possuem limitações de propriedade técnica e intelectual (ver o projeto BioForge TransBacter, no qual estavam melhorando a alternativa à transformação de Agrobacterium para uma maior liberdade de operação). Uma das maiores limitações técnicas de laboratórios é que muitos vetores ainda usados são relíquias históricas com características precárias que tornam as construções de DNA embaraçosas ou incômodas: a origem de replicação de baixa cópia resulta em DNA de baixo rendimento que prepara replicões instáveis, causando perda variável do plasmídeo durante Propagação grande tamanho falta de locais de restrição convenientes para manipulação escolha limitada de marcadores selecionáveis para bactérias e plantas ausência de formas simples de construir fusões de genes repórter O esqueleto do vetor pCAMBIA é derivado dos vetores pPZP (construídos por Hajdukiewicz, Svab amp Maliga, see References ). Embora não sejam perfeitos e possuam limitações técnicas e de IP (ver o Projeto BioForge GUSPlus, no qual estavam aprimorando os genes repórter e métodos de seleção para maior liberdade de operação), os vetores pCAMBIA oferecem: número de cópias elevado em E. coli para rendimentos de DNA elevados replicão pVS1 Para alta estabilidade em tamanho pequeno de Agrobacterium, 7-12kb dependendo de quais locais de restrição de plasmídeo projetados para modificações de plasmídeo modulares e pequenos mas adequados polietiladores para introduzir seu DNA de interesse seleção bacteriana com cloranfenicol ou kanamicina seleção de plantas com higromicina B ou canamicina (fosfinotricina A selecção foi descontinuada a pedido do proprietário do IP, Bayer, após a distribuição inicial em 1997) meios simples para construir fusões de tradução para genes repórter gusA. Alguns pontos sobre a estratégia de clonagem de pCAMBIA: O poliligante pUC18 foi utilizado em alguns vectores, mas os polilinkers pUC8 e pUC9 também foram utilizados para simplificar a escolha da enzima de clonagem. Na idade de PCR, não é mais necessário ter um grande número de locais de clonagem. Os polilinkers menores também eliminam conflitos potenciais de sites como Sph I (que tem um ATG) ou Xba I (que tem um TAG). Isto torna outros locais no vector mais úteis (tais como o sítio Sph I fora da Fronteira T-DNA direita ou o sítio Sac II fora da Fronteira T-DNA esquerda). Os genes de selecção de plantas nos vectores pCAMBIA são conduzidos por uma versão de potenciador duplo do promotor CaMV35S e terminados pelo sinal de poliA CaMV35S. NOTA que este promotor 35S pode ter um efeito potenciador na expressão de outros genes na mesma cassete, pelo que os resultados da expressão génica utilizando derivados pCAMBIA em que partes deste promotor ainda estão presentes devem ser interpretados com precaução. Além disso, é sua responsabilidade verificar se o promotor 35S ou quaisquer outros componentes que você usa estão sujeitos a patentes em seu país. Você pode encontrar ajuda com isso no site CAMBIAs Patent Lens. Os genes relatores apresentam uma marca hexa-Histidina no terminal C para permitir a purificação simples em resinas de cromatografia de afinidade de metal imobilizado. A sequência para esta etiqueta ocorre entre o primeiro local Nhe I (existe um segundo local Nhe I no pVS1-rep que não eliminámos) eo sítio Pml I único. Os genes de interesse podem ser inseridos no lugar do gene repórter. A inserção sem um codão de paragem e no enquadramento no (primeiro) sítio Nhe I acrescentará uma etiqueta de hexa-Histidina à sua proteína de interesse. A inserção sem um codão de paragem e no enquadramento no local Pml I irá acrescentar um codão de paragem. A inserção no sítio Bst EII não adicionará nem uma etiqueta nem um codão de paragem (de modo que pode querer assegurar que uma sequência inserida aqui contenha um codão de paragem). Nomenclatura dos vetores pCAMBIA: O sistema de numeração de quatro dígitos funciona da seguinte maneira: Primeiro dígito - indica a seleção da planta: 0 para a ausência 1 para a resistência à higromicina 2 para a canamicina e 3 para a fosfinotricina (os vetores contendo o gene de resistência à fosfinotricina não estão mais disponíveis na CAMBIA em O pedido da Bayer, que possui patentes que restringem a sua utilização em alguns países). Segundo dígito - indica selecção bacteriana: 1 para espectinomicina / resistência a estreptomicina 2 para cloranfenicol 3 para canamicina 4 para espec / strep e canamicina. Terceiro dígito - indica o poliligador utilizado: 0 para o poliligador 8 de pUC18 para o poliligador 9 de pUC8 para o poliligante pUC9. Quarto dígito - indica o (s) gene (s) repórter (s) presente (s): 0 para nenhum gene repórter 1 para E. coli gusA2 para mgfp 5 3 para gusA: mgfp 5 fusão 4 para mgfp5: gusA fusão 5 para Staphylococcus sp. GusA (GUSPlus). Quinto dígito - nota alguma outra característica especial. Até agora isto tem sido utilizado apenas com: pCAMBIA1305.1 e plasmídeos derivados dele, onde o .1 denota a ausência de um péptido sinal da proteína GUSPlustrade e pCAMBIA1305.2 onde o .2 denota a presença do péptido sinal GRP para In planta secreção da proteína GUSPlustrade. A letra retardada X indica que o gene repórter carece de seu próprio codão de iniciação e o vetor é para criar fusões para o repórter Z indica a presença de uma lacZa funcional para a seleção azul-branca a / b / c indica o quadro de leitura para fusões com o fusível E Usar vetores. Nota importante . Devido a limitações de recursos, nem todas as combinações de características vetoriais possíveis foram criadas em CAMBIA. Você pode inicialmente ficar desapontado ao descobrir que nós não temos, por exemplo, um pCAMBIA2205.2. Os vetores foram projetados contudo, de modo que deveria ser uma questão relativamente simples para um pesquisador que necessitar desse vetor para construí-la a partir dos componentes em outros vetores. Se você criou um derivado de vetor pCAMBIA que outros pesquisadores acharão útil e você quiser compartilhar com outros pesquisadores, envie um e-mail. Vector Vector Addendum: Nota importante para os usuários de pCAMBIA Este vetor é uma parte de uma nova série de vetores pCAMBIA GT-BACK (gene Transfer-Bacterial Acquired Competence com seleção de kanamicina) que engloba uma versão modificada de pCAMBIA 1105.1 e um fragmento do plasmídeo Ti (Derivado de pTiBo542) contendo apenas os operões virA, virB, virC, virD, virE, virG, virK e amp virJ. Este novo vector unitário permite que a capacidade de transferência de ADN seja movida para, e estabilizada, numa gama muito mais ampla de bactérias e será fornecida como um conjunto de ferramentas de código aberto. As características de valor acrescentado do novo vector sobre a Tecnologia Transbacter são: touro Pode ser distribuído como manchas de ADN diluído no papel (por exemplo numa carta) eliminando a necessidade de conformidade com os controlos de importação de organismos vivos e outras questões de quarentena. Este é o meio pelo qual, literalmente, milhares de laboratórios em todo o mundo obtiveram (e enviaram mais) conjuntos de vetores pCAMBIA. O vector Bull GT-BacK carece do derivado de RK2 oriT transportado pela Transbacter, eliminando ou reduzindo assim a capacidade do plasmídeo de ser conjugado e transmissível a outros hospedeiros por funções de conjugação de RK. Bull Ele tem uma ampla gama de hospedeiros replicação origem de pVS1 permitindo um espectro muito mais amplo de bactérias a serem exploradas como vetores de transferência de genes, permitindo escolhas de simbiontes benignos que não impõem estresse físico ou genético em plantas. Estes vetores contêm uma série de locais de restrição em ambos os lados do polilinker pUC8 (0380) ou pUC9 (0390), tornando-os adequados para fins de construção avançada com os usuários inserindo Seus próprios promotores, genes de selecção, genes repórter, etc. Os únicos sinais funcionais entre as fronteiras de T-ADN são os codões de início e de paragem, o marcador de histidina e o sinal NOS-poli (A). Estão presentes todas as características padrão do backbone pCAMBIA: selecção bacteriana de canamicina, número de cópias elevado em E. coli. E replicação estável em A. tumefaciens. PCAMBIA1200 pCAMBIA1300 pCAMBIA1380 pCAMBIA1390 pCAMBIA2200 pCAMBIA2300 Os investigadores que desejam as versões mais recentes devem ver pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 ou pCAMBIA 1305.2. Que pode ser solicitada através do Projeto BioForge GUSPlus. Informações sobre os vetores mais antigos da pCAMBIA estão aqui por conveniência. Estes vectores contêm sequências heterólogas mínimas para a transformação de plantas e selecção de transformantes que permitem a inserção de genes desejados para transformação em plantas mas requerem todas as sequências promotoras e terminadoras para expressão em plantas de genes recentemente clonados. Os vectores de selecção mínimos têm um de dois genes de selecção de plantas: hpt II que codifica a resistência à higromicina, ou npt II que codifica a resistência à kanamicina. Em ambos os casos, o gene de selecção é conduzido por uma versão de potenciador duplo do promotor CaMV35S. Estes genes foram sujeitos a mutagénese dirigida para eliminar locais de restrição de interferência dentro da sequência de codificação por alterações silenciosas. São fornecidos dois marcadores de resistência bacteriana diferentes (kanamicina ou cloranfenicol), permitindo a utilização de uma ampla gama de estirpes de Agrobacterium ou E. coli. O poliligante pUC18 dentro do fragmento l acZa permite o rastreio azul / branco de clones no trabalho de clonagem de E. coli. PCAMBIA1380 e 1390 baseiam-se em pCAMBIA1300, mas o fragmento polylinker-lacZa de pUC18 foi eliminado e substituído pelos polilinkers pUC8 (1380) e pUC9 (1390) mais simples, que não contêm codões de início ou de interrupção potencialmente confundidores. O formato modular completo é proporcionado para clonagem de PCR conveniente e expressão genética. Para os pesquisadores que realizam a análise do promotor, recomenda-se a utilização do vetor mínimo contendo GUSPlus (pCAMBIA 0305.2, que pode ser encomendado pelo Projeto BioForge GUSPlus), em vez de qualquer dos outros vetores pCAMBIA. As estratégias de co-transformação são desejáveis para separar fisicamente no genoma da planta transformada o promotor do gene de selecção de plantas (normalmente 35S) e o promotor de interesse (muitas vezes muito mais fraco ou mais específico) a conduzir um gus ou outro gene repórter. A forma como temos vindo a fazer isto durante anos é que dois vectores são transformados separadamente na mesma estirpe de Agrobacterium (ou mais preferencialmente estirpes do BioForge TransBacter Project para liberdade de operação), mas obviamente a co-transformação também pode ser feita por Transformando simultaneamente com dois isolados separados contendo cada um dos vectores. Se se utilizar um isolado, são seleccionadas colónias isoladas, o ADN plasmídico analisado, as células induzidas em meios especiais (se necessário para a sua espécie vegetal) e as duas linhas celulares são misturadas imediatamente antes da aplicação nos tecidos da planta a transformar. Em nossas mãos este método dá 10-30 de linhas de plantas transformadas contendo T-DNAs. PCAMBIA1201 pCAMBIA1301 pCAMBIA2201 pCAMBIA2301 Os investigadores que desejam as versões mais recentes devem ver pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 ou pCAMBIA 1305.2. Que pode ser solicitada através do Projeto BioForge GUSPlus. Informações sobre os vetores mais antigos da pCAMBIA estão aqui por conveniência. Estes vectores contêm uma construção repórter gus A totalmente funcional para análise simples e sensível da função ou presença de genes em plantas regeneradas por ensaio GUS. A construção utiliza E. coli gusA (N358Q mdash para evitar a glicosilação ligada a N) com um intrão (a partir do gene da catalase de mamona) dentro da sequência de codificação para assegurar que a expressão da actividade glucuronidase é derivada de células eucarióticas, não da expressão por resíduos A. tumefaciens. O gene repórter gusA é clonado num novo formato modular. Estes plasmídeos são adequados para inserção de outros genes de interesse contendo o seu próprio promotor e terminador. Os pesquisadores podem extirpar o gene gusA e inserir seu próprio gene de interesse em seu lugar ou usar esses vetores para criar fusões de gusA com seu gene de interesse (se você criou um derivado de vetor pCAMBIA que outros pesquisadores acharão útil e gostaria de compartilhar Ele, por favor, deixe-nos saber). Estes vectores contêm o polilinker-lacZa de pUC18 e os mesmos genes de selecção de bactérias e plantas que os respectivos Vectores de Selecção Mínima correspondentes. PCAMBIA1302 pCAMBIA1303 pCAMBIA1304 Para aqueles que desejam o melhor dos dois mundos nos genes repórter, construímos esses vetores, semelhantes em utilidade aos Vetores de Seleção Intron GUS (GIS), mas incluindo GFP. Ser uma proteína não catalítica coloca um limite intrínseco na sensibilidade de detecção com proteínas fluorescentes e equipamento caro é necessário para ensaios quantitativos e observação microscópica. GFP é, no entanto popular como um gene repórter e nós fornecê-lo clonado em pleno formato New Modular para aqueles que desejam usá-lo. Estes vectores baseiam-se na pCAMBIA1301 (resistência à kanamicina bacteriana, selecção de higromicina nas plantas, poliligante pUC18 em lacZa), mas contêm a versão mgfp 5 da proteína fluorescente verde Aequoria victoria (Siemering et al., 1996) quer isoladamente - pCAMBIA1302 - quer em fusão translacional Com gusA (N358Q) em ambos os arranjos: pCAMBIA1303 tem uma fusão gusA-mgfp5-His6 e pCAMBIA1304 tem uma fusão mgfp5-gus A-His6. Estas são versões intrones de gusA (N358Q), pelo que há a possibilidade de que a expressão em transformantes primários seja o resultado da expressão das proteínas repórter por células de Agrobacterium tumefaciens residuais ou outras bactérias presentes em culturas de plantas. A análise de um grande número de transformantes de arroz e Arabidopsis em CAMBIA mostrou que a fluorescência produzida pela proteína MGFP5 era bastante fraca. Como resultado disso, nossos pesquisadores construíram construções semelhantes usando o gene egfp disponível de Clontech. Os resultados com essas proteínas foram muito superiores e, embora não possamos distribuir vetores contendo esse gene, recomendamos que os pesquisadores adquiram pEGFP de Clontech e usem isso para construir seus próprios plasmídeos análogos a pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 ou pCAMBIA1304. PCAMBIA1381 e 1391 e as suas variantes de Xa, b, c ORF Concebidos para utilizar o gus A como um verdadeiro repórter da expressão génica por construção de fusão, estes vectores derivam de pCAMBIA1380 e 1390 e contêm um gus A (N358Q) sem promotor, (Sem um codão de iniciação) em três quadros de leitura e com polilinkers orientados por pUC8 ou pUC9. Isto permite a construção simples de fusões de proteínas carboxi-terminais a gusA. Selecção de plantas é com higromicina, e selecção bacteriana com canamicina. Os vectores pCAMBIA1381 e 1391 podem também ser utilizados para a construção de fusões de transcrição ou de tradução para o gus A. São semelhantes às séries Xa, b, c, embora retêm o codão de iniciação do sítio Nco I na nova estrutura modular em torno do gus A (N358Q), e estão apenas disponíveis numa única grelha de leitura. PCAMBIA1281Z pCAMBIA1291Z pCAMBIA1381Z pCAMBIA1391Z Concebido para testes de promotores in planta. Estes vectores apresentam uma versão sem promotor de gus A (N358Q) com o intrão de catalase imediatamente a jusante de uma lacZa truncada contendo o poliligador pUC8 ou pUC9. Todos os plasmídeos nesta série têm higromicina como o gene de selecção de plantas, e a selecção bacteriana está disponível com cloranfenicol (1281Z, 1291Z) ou canamicina (1381Z, 1391Z). A lacZa truncada é funcional para rastreio azul / branco de clones em estirpes hospedeiras de E. coli adequadas. A experiência com estes vectores demonstrou que o promotor 35S muito forte (na verdade uma versão de potenciador duplo) que conduz o gene hptII no ADN-T destes e da maioria das outras pCAMBIA causa interferência significativa nos padrões de expressão observados. Interpretar os resultados com precaução Os transformantes de controlo negativo criados utilizando um destes vectores sem um promotor adicionado a montante do gene gusA apresentam expressão GUS de baixo a moderado nível numa gama de tecidos. Experiências de armadilha realçador realizadas em CAMBIA utilizando versões um tanto rearranjadas destes vectores também mostraram uma expressão interferente consistente que atribuímos ao promotor 35S próximo. Essa expressão artefactual pode ser exacerbada em experimentos onde os pesquisadores tentam analisar versões reduzidas de seus promotores de interesse sem as sequências isoladoras naturais de promotores de comprimento total. Para evitar esta interferência de 35S a partir de análises de promotores, recomendamos o uso de estratégias de co-transformação como descrito acima na secção sobre os Vectores de Selecção Mínimos. Numa tal estratégia, o promotor de interesse pode ser clonado num dos nossos Promoter Cloner Vectors, mas isto deve primeiro ser modificado executando uma digestão dupla Sma I amp Xmn I, purificação em gel do grande fragmento de esqueleto (8,9 kb) e auto-estima - ligação. Tal vector pode ser denominado pCAMBIA0381Z, mas nunca o construímos para distribuição como parte do kit de vectores pCAMBIA. Genótipos de algumas cepas úteis de Agrobacterium tumefaciens. O uso de Agrobacterium é limitado em jurisdições como os EUA, e pode ser imprudente usá-lo em qualquer pesquisa que possa resultar em um produto para venda ou importação para os EUA. Você pode querer usar o sistema Transbacter em vez de liberdade para operar. Para obter informações, consulte o Projeto BioForge TransBacter. LBA4404 (Ach5 pTiAch5) Sm / Sp (R) no plasmídeo de virulência (a partir de Tn904) todos os T-DNA de pTiAch5 foram eliminados em pAL4404 (Hoekema et al., 1983). EHA101, genótipo C58 pTiBo542 T-região :: aph, Km (R) A281 derivado contendo pEHA101, T-DNA substituído por nptII, eliminação de T-DNA limites não confirmados, super-virulentos (Hood et al., 1986). EHA105 é um Km (S) derivado de EHA101 (Hood et al., 1993). O AGL0 é um EHA101 com a região T suprimida, que também elimina o gene aph (Lazo et al., 1991). O gene AGL0 é AGL0 (C58 pTiBo542) recA :: bla, A281, estirpe reconstruída, derivada de A136 (C58 curado) que abrigava pTiBo542, super-virulenta (Hood et ai, 1986). Tipos Ach5. Agrocinopina, octopina tipo B6S3, A6. Octopina tipo Bo542. Leucinopina, succinamopina, tipo agropina, vir mais fraco do que A281 C58, T37. Nopalina tipos A281. Succinamopina, leucinopina, agrocinopina Antibióticos Cloranfenicol, 100 microg / mL para a estirpe AGL1, 10 microg / mL para LBA4404, 25 microg / mL para EHA105 e para E. coli. Kanamicina, 50 microg / mL para Agrobacterium e E. coli. Para a seleção de plantas de arroz transformadas usamos higromicina em 50 μg / mL e 25 μg / mL para o tabaco. Chen L, Zhang S, Beachy RN, Fauquet CM (1998) Um protocolo para a produção consistente e em larga escala de plantas de arroz transgênico fértil. Plant Cell Reports 18: 25-31 Christou P (1991) Produção de plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa L.) a partir de variedades agronomicamente importantes de índica e japonica via aceleração de partículas de descarga elétrica de DNA exógeno em embriões zigóticos imaturos. Biotechnology 9: 957-962 Christou P (1997) Transformação do arroz: bombardeamento. Plant Mol Biol 35: 197-203. Deblaere R, Reynaerts A, Hofte H., Hernalsteens JP, Leemans J, e Van Montagu M (1987) Vectores para clonagem em células vegetais. Meth Enzymol 153: 277-292 Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P. (1994) A pequena família pPZP versátil de vectores binários de Agrobacterium para a transformação de plantas. Planta Mol Biol 25: 989-994 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Transformação eficiente de arroz (Oryza sativa L.) mediada por Agrobacterium e análise de sequência dos limites do T-DNA. Plant J 6: 271-282 Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Estratégia de vector binário baseada na separação das regiões vir e T do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Nature 303: 179-180 Hood EE, Helmer GL, Fraley RT, Chilton MD (1986) A hipervirulência de Agrobacterium tumefaciens A281 é codificada numa região de pTiBo542 fora do T-DNA. J Bac 168: 1291-1301 Hood EE, Gelvin SB, Melchers S, Hoekema A (1993) Novos plasmídeos auxiliares de Agrobacterium para transferência de genes para plantas (EHA105). Trans Res 2: 208-218 Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) fusões GUS: Beta-glucuronidase como um marcador de fusão genética sensível e versátil em plantas superiores. EMBO J, 6: 3901-3907 Klapwijk PM, van Breukelen J, Korevaar K, Ooms G, Schilperoort RA (1980) T ransposição de Tn904 codificando a resistência à estreptomicina no plasmídeo Ti de octopina de Agrobacterium tumefaciens. J Bac 141: 129-136 Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) Uma biblioteca genómica de Ara bidopsis competente para a transformação de ADN em Agrobacterium. BioTechnology 9: 963-967 Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K (1990) Construção e expressão em tabaco de um gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) contendo um intrão dentro da sequência codificadora. Planta Cell Physiol 31: 805-814 Ooms G, Hooykaas PJJ, Van Veen RJM, Van Beelen P, Regensburg - Tunk JG, Schilperoort RA (1982) Octopina Os mutantes de deleção de plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens com ênfase no lado direito do T - região. Plasmid 7: 15-29 Peralta EG, Hellmiss R, Ream W (1986) Overdrive, um potenciador de transmissão de T-DNA no plasmídeo indutor de tumores de A. tumefaciens. EMBO J 5: 1137-1142 Porath, J. (1992). Cromatografia de afinidade por iões metálicos imobilizados. Protein Expre Purif 3: 263-281 Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J (1996) Mutações que suprimem a termossensibilidade da proteína fluorescente verde. A intensificação da expressão de genes estranhos por um intrão de dicotiledóneo em arroz mas não em tabaco está correlacionada com um nível aumentado de ARNm E um splicing eficiente do intron. Nucl Acids Res 18: 6767-6770 Outros recursos Se você deseja discutir ou consultar qualquer material da CAMBIA, envie um e-mail para materialscambia. org Leia Perguntas Frequentes sobre como solicitar materiais da CAMBIA Leia Perguntas Frequentes sobre os vetores da pCAMBIA Informações GUSPlus no Projeto BioForge GUSPlus. Departamento de Fitopatologia e Fisiologia de Culturas, Universidade Estadual de Louisiana e LSU AgCenter, Baton Rouge, EUA. Copyright cópia 2013 Norimoto Murai. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença Creative Commons Atribuição, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original é devidamente citado. Recebido em 7 de março. 2013 revisado em 4 de abril. 2013 aceito 13 de abril. Agrobacterium tumefaciens Vectores Binários pRK2 pRi pSA pVS1 T-DNA Ti Plasmídeo Esta revisão relata o desenvolvimento dos vetores binários de plantas do plasmídeo Ti em Agrobacterium tumefaciens durante os últimos 30 anos. Foi concebida uma estratégia de vector binário em 1983 para separar a região de ADN-T num pequeno plasmídeo a partir dos genes de virulência em plasmídeo Ti avirulento sem T-DNA. Os vectores de pequena planta com a região de T-DNA têm sido simplesmente chamados de vectores Ti binários. Um vector Ti binário consiste num replicão amplo de gama hospedeira para propagação em A. tumeraciens, um gene de resistência a antibióticos para selecção bacteriana e a região T-DNA que seria transferida para o genoma da planta através da maquinaria de virulência bacteriana. A região de T-DNA delimitada pelas sequências de bordas direita e esquerda contém um gene de resistência a antibióticos para selecção de plantas, gene repórter e / ou quaisquer genes de interesse. Adicionou-se também o replicão ColEI ao esqueleto do plasmídeo para aumentar a propagação em Escherichia coli. Uma tendência geral no desenvolvimento do vector binário tem sido aumentar a estabilidade do plasmídeo durante um longo período de co-cultura de A. tumefaciens com os tecidos da planta hospedeira alvo. Uma segunda tendência é compreender o mecanismo molecular de uma ampla replicação de gama hospedeira e utilizá-la para reduzir o tamanho do plasmídeo para facilidade na clonagem e para um maior rendimento do plasmídeo em E. coli. O vasto replicador de gama de hospedeiros de VS1 mostrou ser uma escolha de replicão sobre os de pRK2, pRi e pSA devido à estabilidade superior e de pequeno replicão bem definido. Os vectores binários de plantas recentemente desenvolvidos pLSU têm o pequeno tamanho do esqueleto plasmídico (4566 pb) consistindo em replicão VS1 (2654 pb), replicão ColE1 (715 pb), um gene de resistência à kanamicina bacteriana (999 pb) ou tetraciclina e o ADN-T Região (152 pb). Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria Gram-negativa do solo e patógeno vegetal causando doença da vesícula biliar em angiospermas e gimnospermas 1. A interação agrobacterium-planta foi um dos primeiros sistemas modelo em que o mecanismo molecular para a patogenicidade das plantas foi elucidado em detalhes 2,3. Um segmento de ADN de aproximadamente 20 kpb (ADN-T) num plasmídeo indutor de tumor (plasmídeo Ti de 200 kbp) é transferido da bactéria para o genoma do plano hospedeiro por uma maquinaria molecular que se assemelha muito a uma transferência conjugal bacteriana 4-6. O fenótipo da doença é uma manifestação da expressão de genes de T-DNA bacterianos em células vegetais que é a sobreprodução de duas hormonas de crescimento de plantas, citoquinina e auxina. Este sistema de transferência de DNA natural foi explorado para introduzir genes de interesse agronómico em plantas que resultaram na produção de culturas geneticamente modificadas por campanhas de biotecnologia de plantas. As abordagens iniciais de transferência de genes foram para introduzir um gene alvo na região T-DNA do plasmídeo Ti depois de uma recombinação de simples (cointegração) ou dupla homóloga entre um vector intermediário (pRK290) e o plasmídeo Ti 7, 8. Uma estratégia de vetor de planta binária foi projetada para separar a região de T-DNA em um pequeno plasmídeo dos genes de virulência em plasmídeo 9. Os pequenos vetores de planta com a região de T-DNA foram simplesmente chamados de Ti binário Vectores 10,11. 2. Origem de Replicação de Origem de Replicação de pRK2 do Grupo de Incompatibilidade IncP-1 Quase todos os vectores binários utilizaram uma origem de replicação de pRK2 no início da sua aplicação (Tabela 1). Tabela 1. Panorâmica dos vectores de Ti binários de plantas listados com base nos amplificados replicões de gama de hospedeiros utilizados para a propagação em Agrobacterium tumefaciens e / ou Escherichia coli. PRK2 é um grande plasmídeo de 56 kbp do grupo de incompatibilidade P-1. Nota: 1: Foi adicionado o replicão ColEI derivado de pBR322 ou pUC18 para promover a propagação de vectores Ti binários em E. coli 2: Mobilização (Mob) de vectores binários assistidos por pRK2013 de E. coli para A. tumefacience possível (Sim) ou Não possível (Não) por triparental 3: Selecção bacteriana por antibióticos: cloranfenicol (chl), kanamicina (kan), gentamicina (gen), espectinomicina (spc), estreptomicina (str) ou tetraciclina (tet). A origem das sequências de fronteira de T-DNA derivadas de plasmídeos Ti de tipo nopalina (nop) ou octopina (oct), sequência de fronteira consenso de plasmídeo Ti de tipo nopalina (cons) 5: Os genes marcadores de selecção expressíveis em plantas, uma sequência promotora ou terminadora derivada do gene da nopalina sintase (nop), do gene da octopina sintetase (oct), do gene da sintase da manopina (mas), do 35S (35S) ou da Morfologia Tumoral Grande (tml) T - DNA gene. O gene de resistência a Bialaphos (BAR) confere resistência ao herbicida glufosinato. O gene Gentamicina Acetil Transferase (aacC1) confere resistência à gentamicina em plantas. As regiões codificadoras de Higromicina Fosfotransferase (HPT) conferem a resistência à higromicina em plantas. As regiões codificadoras de Neomicina Fosfotransferase (NPTII) conferem a resistência à kanamicina em plantas. Foi indicada a localização do gene marcador de selecção de planta proximal às seqüências de Fronteira Esquerda (LB) ou de Fronteira Direita (RB). Originalmente isolada de Klebsiella aerogenes 12. Uma característica útil do replicão P-1 é uma extensa gama de hospedeiros entre bactérias Gram-negativas. O pRK2 é replicado e mantido em Esherichia coli, A. tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas aeruginosa e outras espécies. Derivados menores de pRK2 foram gerados, tais como pRK290 de 20,0 kbp, pTJS133 de 11,0 kbp, pRK252 de 10,3 kbp e pTJS75 de 7,0 kbp. A replicação de derivados pRK2 requer região de oriV e trfA de 700 pb e a manutenção estável destes plasmídeos requer regiões adicionais dependendo das espécies . Para Agrobacterium, a manutenção estável do plasmídeo numa condição não selectiva após 35 gerações diminuiu progressivamente de pRK2 (100) para pTJS133 (96), pRK290 (89), pTJS75 (57) e pRK252 (12). O menor derivado de pRK2 pTJS75 tem resistência a oriV, trfA, oriT e tetraciclina. O derivado mais estável pTJS133 em Agrobacterium foi gerado pela adição de uma região de 3,1 kb contendo korA e korB a pTJS75. Um plasmídeo separado pRK2013 contém os genes de transferência de pRK2, os seus próprios genes de mobilização e o replicão ColE1 e é utilizado por acasalamento triparental para transferir plasmídeos pRK2 de E. coli para A. tumefaciens. Assim, a principal limitação dos plasmídeos derivados de pRK2 a serem utilizados para os vectores binários são os múltiplos loci múltiplos necessários para a replicação e manutenção de plasmídeos (11,0 kbp pTJS133). Outra limitação é que os plasmídeos menores derivados de pRK2 (pRK252 de 10,3 kbp, pTJS75 de 7,0 kbp e vector de replicão mini-pRK2 de 5,0 kpb) foram mantidos de forma menos estável em Agrobacterium em condições não selectivas 14,15. 2.1. Vectores binários baseados em pRK252 Um derivado de pRK2 mais pequeno, pRK252 de 10,3 kbp, foi a espinha dorsal de um primeiro vector binário pBin19 (11,8 kbp) com adição do gene NPTIII de Streptoccocus faecalis para a resistência à kanamicina bacteriana, fronteiras de T-ADN de nopaline pTiT37, PBI121 (14,7 kpb) e outras construções pBI, e pBIG / pBIB foram baseadas em pBin19 com a adição de um novo repórter de GUS (lacZ locus) para selecção e sítio de poliligação de M13mp19 Gene 35S: GUS: nï¿½ 17,18. O pAGS127 (15,0 kpb) tem um esqueleto pRK252 com a região T-DNA consistindo em borda direita pTiA6 de octopina e margem esquerda pTiAch5 de octopina, um marcador de selecção de planta nOS: NPTII: ocs, loco lac Z e poliligante e sítio cos para um grande Introdução do fragmento de ADN 19. 2.2. Vectores binários baseados em pRK290 pRK290 foi o primeiro plasmídeo derivado de pRK2 desenvolvido para um vector vaivém entre E. coli e S. meliloti para estudar os loci genéticos para a nodulação e fixação de azoto das bactérias fixadoras de azoto 12. pRK290 também foi utilizado como um Intermï¿½io para transferir um gene vegetal para a proteï¿½a de armazenamento de semente de feijol faseolina para TDNA de pTi15955 e depois introduzir o gene para expressï¿½ nos genomas de girassol e tabaco 8,20. Um vetor binário pOCA18 (24,3 kpb) possui o esqueleto de pRK290 e a região de T-DNA dos bordos direito e esquerdo da octopina pTi, um marcador de seleção de planta ns: NPTII: ocs e local de cos para inserção de biblioteca de DNA de Arabidopsis thaliana 21. Similarmente, , PJJ1881 (25,7 kpb) tem o esqueleto pRK290 com borda direita pTiA6 de octopina e fronteiras esquerdas pTiAch5, um marcador de selecção de planta nOS: NPTII: gene ocs, poliligante, 35S: GUS ou SPT: nos (SPT, Streptomycin PhosphoTransferase) ou transposons de milho Ac ou Ds 22. Verificou-se que o derivado de vector pJJ1881 baseado em pRK290 mantém de forma estável fragmentos de ADN acima de 300 kbp em E. coli 23, 24. 2.3. Vectores binários baseados em pTJS75 O plasmídeo pTJS75 era o derivado mais pequeno (7,0 kbp) de pRK2 e utilizado para gerar vectores binários pGA471 (15,6 kb) 25,26 e pTRA409 (11,5 kbp) 27. O vector pGA471 possui nopalina pTiT37 fronteiras direita e esquerda , Um gene de marcador de selecção de planta nos: NPTII: nsa, local de cos e replicão de ColE1 em T-DNA. O vector pTRA409 tem o ADN-T com a octopina pTi15955 direita (com overdrive) e as bordas esquerdas, um gene marcador de selecção de plantas tml: NPTII: tml e utilizado para testar mutantes de deleção do promotor do gene de faseolina da proteína de armazenamento de semente de feijão. 2.4. Vectores binários com base no replicador mini-pRK2 O vector binário pPCV001 (9,2 kbp) tem um replicão mini-RK2 condicional (oriV e oriT) e pode ser mantido em Agrobacterium e E. coli apenas quando coexistiu em trans com o trf e o tr Loci num plasmï¿½eo auxiliar pRK2013 ou no cromossoma 14 de E. coli. A regiï¿½ T-DNA de pPCV001 tem nTpalina pTiC58 beira direita e octopina pTiB6S3 beira esquerda, um gene marcador de selecï¿½o de plantas nï¿½: NPTII: ocs e sequï¿½cia pBR322 para resgate de plasmï¿½eo Experimentos 28,29. O vector binï¿½io pCB301 (5,0 kpb) foi construï¿½o por clonagem por PCR de um replicï¿½ de mini-pRK (oriV e trfA) e de um gene de resistï¿½cia a canamicina NPTIII bacteriana com base na sequï¿½cia de ADN de pBin19 15. A regiï¿½ T-DNA consiste em nopalina pTiT37 direita e esquerda Fronteiras, nï¿½s: BAR: nï¿½ gene marcador de selecï¿½o de plantas (Bar, herbicida glufosinato) e poliligante pBlueScriptII para clonagem. 3. Agrobacterium rhizogenes pRi Origem da Replicação O Agrobacterium rhizogenes é um patógeno vegetal que vive no solo, causando a doença de raízes pilosas. Um grande plasmídeo pRi de 200 kbp tem a região de T-DNA e de virulência e é responsável por causar o fenótipo da doença. A origem de replicação do plasmídeo pRi localiza-se dentro do fragmento BanHI-11 de 8,1 kb e pode coexistir de forma estável com a origem de replicação de pTi em A. tumefaciens. O vector binï¿½io pC22 (17,5 kb) tem a origem de replicaï¿½o de pRiHR1 e ColE1, gene de resistï¿½cia bacteriana para ampicilina / carbenicilina ou estreptomicina / espectinomicina 30. A regiï¿½ T-ADN de pC22 consiste nos limites direito e esquerdo da octopina pTiB6S3, uma Marcador de selecção de plantas gene nos: NPTII: nsa, local de multi-clonagem (BamHI, XbaI) e o local de cos para a embalagem in vitro da biblioteca genómica de Arabidopsis thaliana. Um segundo vector binário pCGN1547 (14,4 kb) também utiliza a origem de replicação de pRiRH1 e ColE1 e um gene de resistência bacteriana para gentamicina 31. A região de T-ADN do vector tem os limites direito e esquerdo da octopina pTiA6, um marcador de selecção de planta Mas: NPTII: mas, locus lacZ e local de poliligação de pUC18 para clonig. A estabilidade de vectores binários em Agrobacterium foi comparada entre plasmídeos com a origem de replicação de pRi e pRK2, pCGN1547 e pBin19, respectivamente. PCGN1547 era muito mais estável do que pBin19 e após 27 gerações em condições não selectivas 54 de Agrobacterium perdeu o pBin19 enquanto que apenas 1 perdeu pCGN1547. Assim, os vectores binários contendo a origem de replicação pRi têm a maior vantagem na manutenção estável e uma limitação num número de cópias baixo de um ou poucos em células de Agrobacterium. 4. Origem de replicação de gama de hospedeiro largo a partir de pSa de Grupo de Incompatibilidade de IncR Origem de replicação de hospedeiro largo de pSa derivada de um mini-plasmídeo críptico P15A em E. coli. O locus de replicação da região ori e rep de pSa é um dos replicões de ocorrência natural mais pequenos conhecidos (2,3 kbp). As regiões de replicação foram divididas em dois plasmídeos separados como sistemas de vector binário de dois componentes para reduzir o tamanho dos plasmídeos contendo ADN-T 32. pGreen0029 (4,6 kbp) contém um gene de resistência à kanamicina bacteriana, origem de replicação pSa e TDNA com NopalinepTiT37 direita (com overdrive) e bordas esquerdas, e um marcador de seleção de plantas nos: NPTII: ns. O plasmï¿½eo suplementar pSoup (9,3 kbp) tem um gene de resistï¿½cia a tetraciclina bacteriana e uma regiï¿½ de rep de pSa. PSoup deve co-existir em Agrobacterium para a replicação de pGreen. Este sistema de vector binário de dois componentes foi utilizado para construir vectores LucTrap para gerar a fusão transcricional e translacional do repórter de luciferase de vaga-lume para genes direccionados de forma aleatória 33. A estabilidade de vectores binários em Agrobacterium foi comparada entre plasmídeos com a origem de replicação de pSa e pRK2 , PGreen000 e pBin19, respectivamente. PGreen000 foi menos estável do que pBin19 e após um dia em condições não selectivas 50 de Agrobacterium perdeu o plasmídeo pGreen000. Assim, a manutenção estável de vectores binários contendo pSa-repicon em Agrobacterium é a principal limitação para a sua utilização quando necessário para um longo período de co-cultivo de mais de dois dias. Uma nova versão do sistema de vetor binário de dois componentes, pCLEAN-G e pCLEAN-S corresponde a pGreen e pSoup, respectivamente 34. Uma nova característica é que ambos os plasmídeos têm a região de T-DNA delimitada por nopalina pTi consenso bordas direita e esquerda . O ADN-T de pCLEAN-G115 (6,0 kpb) tem um gene marcador de selecção de plantas 35S: HPT: nsa, selecção de lacZ e poliligante. O pCLEAN-S166 suplementar (11,1 kbp) tem um marcador de selecção diferente nos: HPT: nsa em T-DNA (HPT, Hygromycin Phospho Transferase). 5. Origem de Replicação de PVS1 do Grupo de Incompatibilidade IncP pVS1 é um plasmídeo não conjugativo de 29 kbp do grupo de incompatibilidade IncP isolado de Psuedomonas aeruginosa. Verificou-se que o plasmídeo se replicava numa vasta gama de bactérias gram-negativas incluindo outras espécies de Pseudomonas (P. syringae, P. putida) bem como em A. tumefaciens e S. leguminosarun, mas não em E. coli 35. A O derivado pV2S1 de pVS1 contém uma região de 3,7 kbp para o gene de replicação e estabilidade 36. Outro derivado pVS1 pGV910 contém um fragmento de 8 kpb para o gene de estabilidade, replicação e mobilização 37. A estabilidade de pGV910 em A. tumefaciens GV3101 foi comparada com a do replicão pRK2 Contendo pRK290 37. pGV910 era muito mais estável do que pRK290 e após 15 gerações em condições não selectivas apenas menos de 0,5 perdeu pGV910 enquanto que 26 de Agrobacterium perdeu o pRK290. Verificou-se que o plasmídeo pVS1 era compatível com os replicões IncP-1 e IncP-4. A coexistï¿½cia de pGV910 e pRK290 pareceu aumentar a estabilidade de pRK290 e apï¿½ 16 geraï¿½es em condiï¿½es nï¿½ selectivas apenas 12 de Agrobacterium perderam pRK290. A origem da replicação de pVS1 foi definida para um fragmento de 3,1 kpb para staA, ORF3, repA e oriV por análise de sequência, mutagénese e ensaio de manutenção em P. fluorescens 38. A região codificadora de StaA (209 codões) contém dois locais de ligação a ATP E motivos típicos de uma proteína de partição e é essencial para a estabilidade segregacional. O ORF3 (71 codões) não tem semelhança aparente com outras proteínas conhecidas, mas a deleção e os estudos mutacionais mostraram que a ORF3 é importante para a estabilidade segregacional. A proteína RepA com 357 codões partilha uma forte semelhança com outras proteínas RepA. A mutação de Ala 246 para Val 246 aumentou o número de cópias de plasmídeo de 5,9 para 13,8 cópias por cromossoma, a mutação de Asp 260 para Asn 260 reduziu o número de cópias. O locus oriV tem a organização de sequência típica de origem de replicação, uma caixa DnaA, quatro repetições directas de 21 pb cada, uma região rica em AT e uma segunda caixa DnaA. A espinha dorsal do plasmídeo binário pPZP do vector Ti é o fragmento de 3,8 kb da origem de replicação pVS1 e o replicão ColE1 de 1,1 kb e o local bom da pBR322 39. pPZP111 (11,8 kb) tem a região T-DNA consistindo em nTpalina pTiT37 fronteiras direita e esquerda , Um gene de resistência à canamicina ou gentamicina 35S: NPTII ou aacC1: 35S, respectivamente, selecção de lacZ e poliligante a partir de pUC18. PPZP111 tem um gene de resistência ao cloranfenicol bacteriano de pBR325, e pPZP211 (11,9 kb) tem um gene aadA de resistência a estreptomicina / espectinomicina bacteriana, que codifica a aminoglicósido-3-adeniltransferase. Actualmente, uma série de plasmídeos pCAMBIA (9,0 kbp) estão entre os vectores binários Ti mais amplamente utilizados (números de acesso Genbank AF234290-AF234316). Os plasmídeos têm a mesma espinha dorsal dos plasmídeos pPZP e os seus tamanhos são de 6,2 ou 6,4 kb com um gene bacteriano de kanamicina ou de resistência ao cloranfenicol, respectivamente. A região T-DNA é delimitada pelas seqüências de nopalina pTiT37 direita (com overdrive) e borda esquerda. Estï¿½ disponï¿½eis dois tipos de marcador de selecï¿½o de plantas como o gene de resistï¿½cia kanamicina ou higromicina, 35S: NPTII ou HPT: 35S, respectivamente. São fornecidos repórteres de duas-glucuronase, GUS de E. coli (gusA Eco) ou GUSPlus de Staphylococcus sp. (GusA Ssp). Uma segunda proteína fluorescente verde repórter está também disponível quer por si própria (gfp) quer por genes de fusão com GUS (gusA Eco: gfp ou gfp: gusA Eco). A selecção de lacZ com locais de multi-clonagem para inserção foi derivada de pUC18, 8 ou 9. Os vectores de Ti binários modulares pMODUL e pSAT foram desenvolvidos com base em pZP200 (6,7 kbp) como um esqueleto dos vectores 40,41. Os vectores pMODUL aproveitaram o uso de enzimas de ocorrência de baixa frequência, 13 hexanucleótidos e 6 sítios de restrição de ocatanucleótidos, e 5 locais de endonuclease homing para construir seis unidades de expressão diferentes numa única construção. Os vectores modulares pSAT também utilizaram 6 endonucleases de restrição de octanucleótidos e locais de clonagem de recombinação de Gateway para a montagem modular de fusões N-terminal e C-terminal em cinco marcadores autofluorescentes diferentes, proteínas verdes (EGFP), amarelas (EYFP) e cianas fluorescentes ECFP), proteína autofluorescente vermelha (DsRed2 ), E reduziu a proteína fluorescente de cloreto de sódio e de sensibilidade de pH (CitrineYFP). Mais recentemente, construiu-se uma série de vectores Ti binários de elevado rendimento mais elevados, pLSU, para aumentar a eficiência de clonagem e o rendimento do plasmídeo em E. coli e A. tumefaciens 42-44. O tamanho do esqueleto do vector binário pLSU1 foi reduzido para 4566 pb com o replicão ColE1 (715 pb) para E. coli e o replicão VS1 (2654 pb) para A. tumefaciens, um gene de resistência à kanamicina bacteriana (999 pb) ADN (152 pb) (Figura 1). Os vectores Ti binários com o replicão VS1 truncado foram mantidos de forma estável com mais de 98 eficiência em A. tumefaciens sem selecção de antibióticos durante quatro dias de transferências sucessivas. A direcção transcricional do replicão VS1 pode ser a mesma que a do replicão ColE1 (transcrição co-direccional), ou inversa (transcrição directa) como no caso de vectores amplamente utilizados (pPZP ou pCambia). Os novos vectores de pLSU com transcrição co-direccional produziram em E. coli até quatro vezes mais frequência de transformação do que aqueles com a transcrição directa. Em A. tumefaciens o efeito da transcrição co-direcional ainda é positivo em freqüência de transformação até 1,8 vezes maior do que a da transcrição direta. As frequências de transformação de novos vectores são mais de seis vezes superiores às do vector pCambia em A. tumefaciens. Os rendimentos de ADN de novos vectores foram três a cinco vezes maiores do que pCambia em E. coli. A Figura 2 ilustra a composição de T-DNA em pLSU1 a 5. pLSU1 é um vector de esqueleto básico com os doze locais de restrição comuns em TDNA. PLSU2 e 3 têm o gene NPTII de resistência à canamicina como um marcador seleccionável na planta. PLSU4 e 5 contêm o gene HPH de resistência à higromicina como uma planta. Figura 1. Apresentação esquemática da estrutura de estrutura do vector Ti binário pLSU1 (4566 pb). O T-DNA está no topo da figura delimitada pela margem direita (RB) e esquerda (LB) com 12 locais de endonucleases de restrição comuns, EcoRV (EV), SphI (Sp), HindIII (HIII), NcoI (Nc), XhoI (Xh), KpnI (K), EcoRI (EI), BamHI (BH), PstI (P), ScaI (Sc, XbaI (Xb), and SacI (Sa). The backbone plasmid include the Neomycin PhosphoTransferase I (NPTI) , ColE1 origin of replication (ColE1), Stability region A (StaA), Replication region A (RepA), and VS1 origin of replication (VS1). Figure 2. Schematic presentation of the T-DNA region of binary Ti vectors pLSU1 to 5 . pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in T-DNA. pLSU2 and 3 have the Neomycin PhosphoTransferase II gene (NPTII) adjacent to the left border as a plant selection marker for kanamycin resistance. pLSU4 and 5 contain the Hygromycin B Phosphotransferasae gene (HPH) adjacent to the left border as a plant selection marker for hygromycin resistance. pLSU3 and 5 also include the - glucuronidase reporter gene (GUS) in addition to the plant selection marker in the T-DNA. selection marker. pLSU3 and 5 also have the GUS reporter gene in addition to the plant-selectable marker. To be compatible with the Gateway Technology (Invitrogene), pLSU vectors were modified to include a bacterial tetracycline-resistance gene 42. The size of the tetracycline resistance gene TetC from pBR322 was reduced to 1468 bp containing 1191 bp of the coding region, 93 bp of 5 upstream, and 184 bp 3-downstream region. The final size of basic binary vector backbone pLSU11 is 5034 bp. pLSU12 and13 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant selection marker. pLSU14 and 15 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant-selectable marker. pLSU13 and 15 also have the - glucuronidase (GUS) reporter gene in addition to the plant selection marker. Constructed also was a mobilizable version of tetracycline-based binary Ti vector pLSU16 in which the mob function of ColE1 replicon was maintained for mobilization of the binary vector from E. coli to A. tumefaciens by tri-parental mating. The final size of binary Ti vector backbone pLSU16 is 5580 bp. The author wishes to acknowledge the financial support partly from the Department of Plant Pathology and Crop Physiology, the College of Agriculture, Louisiana State University, and from the Louisiana Agriculture Experiment Station, LSU AgCenter. E. F. Smith and C. O. Towsend, A Plant Tumor of Bacterial Origin, Science, Vol. 25, No. 643, 1907, pp. 671- 673. doi:10.1126/science.25.643.671 I. Zaenen, N. Van Larebeke, H. Teuchy, M. Van Montagu and J. Schell, Supercoiled Circular DNA in Crown-Gall Inducing Agrobacterium Strains, Journal Molecular Biology, Vol. 86, No. 1, 1974, pp. 117-127. doi:10.1016/S0022-2836(74)80011-2 M. D. Chilton, M. H. Drummond, D. J. Merlo, D. Sciaky, A. L. Montoya, M. P. Gordon and E. W. Nester, Stable Incorporation of Plasmid DNA into Higher Plant Cells: The Molecular Basis of Crown Gall Tumorigenesis, Cell, Vol. 11, No. 2, 1977, pp. 263-271. doi:10.1016/0092-8674(77)90043-5 J. R. Zupan and P. 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In this study, a novel binary T-vector was constructed by integrating two Ahd I restriction sites into the backbone vector pCAMBIA 1300. The T-vector also contains a GFP reporter gene and thus, can be used to analyze promoter activity by monitoring the reporter gene. On the other hand, identification and characterization of various promoters not only benefit the functional annotation of their genes but also provide alternative candidates to be used to drive interesting genes for plant genetic improvement by transgenesis. More than 1,000 putative pollen-specific rice genes have been identified in a genome-wide level. Among them, 67 highly expressed genes were further characterized. One of the pollen-specific genes LOCOs10g35930 was further surveyed in its expression patterns with more details by quantitative real-time reverse-transcription PCR (qRT-PCR) analysis. Finally, its promoter activity was further investigated by analyzing transgenic rice plants carrying the promoter:: GFP cassette, which was constructed from the newly developed T-vector. The reporter GFP gene expression in these transgenic plants showed that the promoter was active only in mature but not in germinated pollens. Citation: Jiang S-Y, Vanitha J, Bai Y, Ramachandran S (2014) A Novel Binary T-Vector with the GFP Reporter Gene for Promoter Characterization. PLoS ONE 9(9): e107328. doi:10.1371/journal. pone.0107328 Editor: Xianlong Zhang, National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, China Received: June 4, 2014 Accepted: August 12, 2014 Published: September 8, 2014 Copyright: 2014 Jiang et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License. which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Data Availability: The authors confirm that all data underlying the findings are fully available without restriction. All relevant data are within the paper and its Supporting Information files. Funding: This research is supported by the National Research Foundation, Prime Ministers Office, Singapore, under its Competitive Research Programme (CRP Award No. NRF-CRP7-2010-02). The funder had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Interesses conflitantes: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Introduction Several strategies have been explored to clone DNA fragments from polymerase chain reaction (PCR) into desired vectors. One of the strategies is to incorporate restriction enzyme sites into oligonucleotide primers to create sticky ends by digesting the PCR products. However, the digestion efficiency is low for many restriction endonucleases when their recognition sequences are located within a few base pairs of the end of the PCR products 1. The second strategy is to clone PCR products as blunt-ended fragments. The strategy requires an enzymatic processing to remove a 3 overhang adenosine which was generated by PCR Taq polymerase due to its template-independent terminal transferase activity 2. The third strategy is to directly clone PCR products into a T-vector with 3-T overhang. The strategy is applicable to clone PCR products with 3-T overhang generated by some of thermostable DNA polymerases. A T-vector can be constructed by two ways. One way is to artificially add T-overhang to blunt-ended plasmid DNA by terminal deoxynucleotidyl-transferase (TdT) or Taq polymerase in the presence of dideoxythymidine triphosphate (ddTTP) and dTTP, respectively 3 5. By this way, the prerequisite is that one should first construct a plasmid DNA with blunt-ended restriction enzyme sites. Another way is to directly generate a 3 overhang linear vector by certain restriction enzymes. Several restriction enzymes could be used for that purpose and the examples include Bci VI, Bfi I, Hph I, Mnl I, Taa I, Xcm I and Ahd I ( Eam 1105I) 6 9. The widely employed enzyme is Xcm I. The enzyme has a flexible recognition sites CCANNNNN / NNNNTGG (N A/C/T/G). Thus, a plasmid DNA with the sequence CCANNNNTNNNNTGG can be recognized by Xcm I and be digested to generate a 3 overhang linear vector. Currently, considerable reports have been published to introduce the application of this enzyme in the generation of 3 overhang vectors for cloning PCR products 7. 10 12. Besides Xcm I, little is known about the application of the other enzymes on generating the 3 overhang vector. In addition, most of commercially available T-vectors are not binary vectors and cannot be directly used for Agrobacterium - mediated genetic transformation. In this study, we have constructed a novel binary T-vector by inserting a 1,317-bp DNA sequence with two Ahd I restriction sites. The T-vector contains a GFP reporter gene and thus, can be used to analyze promoter functions by the GFP gene. Identification and characterization of various promoters not only benefit the functional annotation of their genes but also provide alternative candidates to be used to drive interesting genes for genetic improvement of targeted organisms by transgenesis. Among different types of promoters, we are interested in pollen-specific promoters. These promoters can be used to drive expression of some genes to disturb pollen development by genetic transformation and as a result, to develop male sterile lines. Genetically stable male sterile lines are the prerequisite to commercially utilize crop heterosis to improve crop production. Thus, pollen-specific promoters are potentially useful in crop genetic improvement by developing hybrid crop cultivars 13 15 . Some of pollen-specific genes and their promoters were isolated and characterized more than twenty years ago from plants 16. 17. Since then, more numbers of pollen-specific promoters have been characterized and these include petunia PA2 18. tomato LAT52 and LAT59 19. 20. rapeseed Bp10 21. maize Zm13 22. 23. tobacco NTP303 24. Lily cgH3 25 and Arabidopsis promoters TUA1 26. AtPTEN1 27. AtSTP6 28. AtSTP9 29 and AtVEX1 30. Among them, the tomato LAT52 promoter has been widely used to drive pollen-specific expression. In rice, promoters from numbers of genes showed activities in mature pollens and/or pollen tubes and examples include Osnop . OsSCP1 . OsSCP2 . OsSCP3 . OSIPA . OSIPK . and OSIPP3 31 35. Recently, Oo et al (2014) reported 6 genes whose promoter activities were detected in the late stage of pollen formation in the transgenic Arabidopsis carrying the promoter:: GUS / GFP constructs 15 . Pollen development undergoes a complicated biological process from microspores to mature pollen grains. It has been regarded as an ideal model to study various biological processes such as sexual reproduction, cell fate determination, signal transduction, membrane transport, and polar growth. Pollen-specific promoters may be utilized as tools in annotating biological functions of these genes involved in pollen development and regulation. Thus, it is necessary to identify and characterize various pollen-specific promoters whose activities could be detected at only certain stage of pollen development. There are lots of publicly available rice expression databases such as Gene Expression Omnibus (GEO) datasets 36. ArrayExpress 37 and PLEXdb 38. However, limited data are available for focusing on pollen-related expression. Besides the Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) rice database 39. two of microarray datasets are available where pollens and other tissues were taken for expression analysis. One of the datasets contained the expression data from 8 different samples including leaves, callus cells, roots, uninucleate microspores, bicellular pollens, tricellular pollens, mature pollen grains and germinated pollen grains 40. Another dataset contained only 3 samples including seedlings, pollen at anthesis and sperm at anthesis 41. All these data provide the basis for genome-wide identification of pollen-specific genes. In this study, a novel binary T-vector has been developed to facilitate the rapid clone of targeted promoters into the upstream of reporter GFP gene. Considerable numbers of pollen-specific rice genes were also verified in their expression. Additionally, one pollen-specific gene and its promoter were molecularly characterized by using our newly developed T-vector. The data showed that a promoter:: GFP construct could be prepared rapidly by using the novel T-vector and the developed construct could be directly used for Agrobacterium - mediated genetic transformation to generate transgenic plants for detecting the promoter activities through the GFP reporter gene. Our data also showed that the 1,492 bp promoter from the rice gene LOCOs10g35930 was active only at the mature stage of pollens and no GFP activity was observed after pollen germination. Results Construction of the novel binary T-vector The restriction enzyme Ahd I has the recognition site GACNNN / NNGTC (N A/C/T/G). Thus, a DNA fragment with the sequence GACAATAAGTC can be digested by the enzyme Ahd I to generate a 3 T-overhang end. To introduce this sequence into the binary vector pCAMBIA 1300 (www. cambia. org ), two bridge fragments were amplified by PCR with the rice genomic DNA as a template using two primer sets as listed in Table S1 (See Methods in details). The Fragment 1 contains two recognition sites including Hin dIII and Ahd I and the Fragment 2 has two recognition sites including Ahd I and Nco I. These two fragments were then ligated together by the enzyme Spe I (Figure 1A ). The ligated fragment was further digested by both Hin dIII and Nco I to form a Hin dIII - Nco I fragment. The fragment was then ligated with a GFP - containing pCAMBIA 1300 binary vector to develop the vector named as pDsTGFP (Figure 1B ). The vector has two Ahd I sites at the 13 th and 1329 th position, respectively (Figure 1B ). Thus, the 3 T-overhang ends can be generated by digesting the pDsTGFP vector with the enzyme Ahd I (Figure 1C ). Figure 4. Expression heat map of pollen-specific genes by the RNASeq data. In the RNASeq dataset, a total of 10 different developmental stages of tissues were collected for the expression analysis. These tissues were labelled as below: 1, shoots 2, leaves-20 days 3, pre-emergence inflorescence 4, post-emergence inflorescence 5, anther 6, pistil 7, seed-5 days after pollination (DAP) 8, seed-10DAP 9, embryo-25DAP 10, endosperm-25 DAP. The normalized expression values were directly used to generate heat map. The values 0 indicated that no expression signal was detected for these genes in the corresponding tissues. The larger the expression values are, the stronger the genes show their expression. The prefix LOC in locus names is omitted for convenience in this figure. Construction of binary vector carrying the promter:: GFP cassette by using the novel T-vector To further verify the pollen-specific expression of these candidate genes, we randomly selected one gene for promoter activity analysis. The selected gene is with the locus name LOCOs10g35930 . The 1,492 base pairs of DNA sequence upstream of start codon of the gene was amplified from the rice genome by PCR as shown in Figure 2. After verification by sequencing, the PCR fragment was directly ligated to the T-vector prepared by Ahd I digestion of pDsTGFP (Figure 2 ). After transformation, we have obtained a total of 9 colonies and five of them were randomly selected for plasmid DNA preparation and verification. Sequencing analysis showed that two colonies contained the insertion from the PCR fragment with correct orientation. One of the two colonies was selected for Agrobacterium - mediated genetic transformation to generate transgenic rice plants carrying the promoter:: GFP cassette. The gene LOCOs10g35930 was expressed at the mature stage of panicle development As the gene LOCOs10g35930 was selected as a candidate gene to further study its expression profiling by surveying its promoter activity, its expression patterns was also investigated in more details. The achieved data from the MPSS database showed that the gene LOCOs10g35930 was mainly expressed at the mature pollen grains (Figure 5A ). We then analyzed the microarray data with GEO accession number GSE6893, where a total of 15 tissues were collected for expression analysis. The data showed that the gene LOCOs10g35930 has the highest expression signal at the last stage of inflorescence development, where most of pollens are in the mature stage (Figure 5B ). The second microarray data consists of three tissues including seedling, pollens at anthesis and sperms at anthesis. The highest expression level was observed in the pollens at anthesis (Figure 5C ). The third microarray data contained 8 samples and 5 of them were from pollens. The gene LOCOs10g35930 showed the highest expression level in both mature and germinated pollens (Figure 5D ). Besides both the MPSS and microarray data, the RNASeq data (mpss. udel. edu/riceRNAseq ) was also employed for the expression verification (Figure 5E ). Based on the data, the gene exhibited the strongest expression signal at the post-emergence inflorescence (Figure 5E ). At this stage of inflorescence, most of the pollens were at the mature stage. Finally, the quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to verify the expression of this gene. The total RNA samples were prepared from a total of 11 tissues and were then submitted to qRT-PCR analysis (Figure 5F ). The analysis showed that the gene was mainly expressed at the opening panicles and flowering panicles, where majority of pollens were at the mature stage. Thus, our qRT-PCR data further confirmed the expression of this gene in the late stage of panicle development. Figure 5. Detail analysis in the expression patterns of the gene LOCOs10g35930 . (A) The expression profile of the gene shown by the MPSS dataset. Samples were labeled as below: 1, 3-day old germinating seeds 2, 10 days of germinating seedlings 3, 14-day old young leaves 4, 14day old young roots 5, 60-day old mature leaves 6, 60-day old mature roots 7, 60-day old stems 8, immature panicles 9, mature pollens 10, merismatic tissues 11, ovary and mature stigmas 12, rice developing seeds. (B) The gene showed mature inflorescence specific expression according to the microarray dataset with the GEO accession number GSE6893. Samples were labelled as below: 1, 7-day old roots 2, mature leaves 3, young leaves 4, shoot apical meristem 5, 03 cm inflorescence 6, 35 cm inflorescence 7, 510 inflorescence 8, 1015 cm inflorescence 9, 1522 cm inflorescence 10, 2230 cm inflorescence 11, 02 day old seeds, 12, 34 day old seeds 13, 510 day old seeds 14, 1120 day old seeds 15, 2129 day old seeds. (C) The gene showed the highest expression at mature pollens by the microarray dataset with the GEO accession number GSE17002. Samples were labelled as below: 1, seedling 2, pollens at anthesis 3, sperms at anthesis. (D) The gene showed the highest expression level at mature and germinated pollen grains. Samples were labelled as below: 1, callus cells 2, leaves 3, roots 4, uninucleate microspores 5, bicellular pollens 6, tricellular pollens 7, mature pollen grains 8, germinated pollen grains. (E) The gene showed the anther-specific expression by the RNASeq data. The samples were labelled as below: 1, shoots 2, 20 day old leaves 3, pre-emergence inflorescence 4, post-emergence inflorescence 5, anthers 6, pistil 7, 5 day old seeds 8, 10 day old seeds 9, 25 day old seeds 10. 25 day old endosperms. (F) The gene showed the highest expression at the booting and flowering panicles by qRT-PCR. Samples were labelled as below: 1, two-week old leaves 2, two-month old leaves 3, two-week old roots 4, two-month old roots 5, 05 cm long panicles 6, 510 cm long panicles 7, more than 10 cm long panicles 8, booting panicles 9, flowering panicles 10, milky seeds and 11, mature seeds. The promoter activity in transgenic rice plants carrying the promoter:: GFP cassette The gene LOCOs10g35930 encodes a protein of 224 amino acids long with a molecular weight of 24.8 kDa. The domain searches in the Pfam database (pfam. xfam. org/ ) showed that the protein contained a LIM domain (PF00412). In order to investigate the expression activity of its promoter, the promoter:: GFP transgenic plants were generated according to the description in the Methods section. Careful examination of GFP signal in the transgenic plants was carried out in the whole life cycle of rice development. No signal was detected in roots, leaves and stems (Figure 6 AC ) during the whole life cycle. Subsequently, the GFP signals in the florets at different developmental stages of panicles were examined. The results showed that no expression was observed at the early stages of panicles (Figure 6 D and E ). Also, no signal was observed at the early stages of anther development (Figure 6 F and G ). However, the strong GFP expression was observed at the mature stage of anther development (Figure 6H ). Figure 6. The GFP expression activities in various tissues shown by transgenic rice carrying the promoter:: GFP construct. The 1,492 bp of promoter from the upstream of start codon of the gene LOCOs10g35930 was used to drive the expression of the reporter GFP gene. (A) No GFP signal in WT (top) and transgenic (bottom) roots. (B) No GFP expression in WT (top) and transgenic (bottom) leaves. (C) No GFP signal in WT (left) and transgenic (right) stems. (D) No GFP expression in WT (top) and transgenic (bottom) young panicles with less than 3 cm length. (E) No GFP expression in WT (top) and transgenic (bottom) young florets. (F) No GFP expression in WT (left) and transgenic (right) young anthers at the uninucleate microspore stage. (G) No GFP expression in WT (left) and transgenic (right) young anthers at the bicellular pollen stage. (H) No GFP expression in WT (left) and strong GFP signal in transgenic anthers (right) at the mature pollen stage. Bars 1 mm. In order to investigate the expression activity of its promoter at the cellular level, various developmental stages of pollens were squeezed from anthers and were observed under microscope for GFP signal. No obvious GFP signal was observed at the unicellular stage of pollens when compared with the similar stage of pollens from the wild type plants (Figure 7A ). However, at the mature stage of pollens, strong GFP signal was detected. The GFP signal was visualized in the whole area of pollens including membrane, cytoplasm and nucleus (Figure 7 B and C ). The nucleic GFP signal was confirmed by DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) staining at the tricellular stage of pollens (Figure 7D ). In addition, the mature pollens harvested from the promoter - GFP transgenic plants were germinated in vitro and were then observed under microscope. The observation showed that the GFP signal was detected only in the mature pollens and no signal was visualized in the geminated pollens and their tubes (Figure 7E ). Thus, our data suggested that the gene LOCOs10g35930 could be expressed only at the tricellular stage of pollens. Figure 7. The GFP expression activites at various stages of pollens shown by transgenic rice carrying the promoter:: GFP construct. (A) No GFP expression in WT (left) and transgenic (right) pollens at the uninucleate microspore stage. (B) No GFP expression in WT (left) and strong GFP expression in transgenic (right) tricellular pollens. (C) Enlarged images showing the transgenic mature pollens under visible light (left) and GFP signals under epifluorescence (right). (D) The left image shows mature pollen carrying the promoter:: GFP cassette under visible light. The middle image shows GFP signal in the same pollen under epifluorescence and the right image shows DAPI staining at 3 nuclei in the pollen under UV light. (E) Germinated pollens under visible light (left) and their GFP expression level under epifluorescence (right). GFP signal was only observed in the mature pollen and no GFP signal was detected in a germinated pollen and its tube. Arrows indicate the germinated pollen tubes. Bars 50 m. Discussion The novel T-vector is suitable for cloning PCR products amplified by Taq DNA polymerase which can catalyze the addition of an adenine residue to the 3-end of its PCR fragment. If a PCR is carried out using other DNA polymerases, for example, Pfu DNA polymerase, the PCR products are required to be treated by Taq DNA polymerase to add A-overhang in both blunt ends for cloning. As only one overhang nucleotide at the ends of both PCR products and the T-vector, the DNA ligation and subsequent transformation should be carried out in more stringent conditions. Firstly, T-vector fragment should be properly purified. As the fragment is around 10 Kb in size, traditional methods used for gel purification of normal PCR products may not be suitable for the purification of the novel T-vector from agarose gel. Generally, acceptable cloning efficiency could be achieved when commercial columns suitable for large fragment DNA recovery were employed for T-vector purification from agarose gel. Secondly, low cloning efficiency may be observed when a fragment with larger than 2.5 Kb is used for cloning. Based on our experiment, relatively high efficiency could be achieved when PCR fragments ranging from 0.51.5 Kb were used for ligation. Since most of promoter sequences were less than 2 Kb, the novel T-vector should be applicable for cloning of most of promoters for the GFP reporter gene analysis. On the other hand, most of commercially available T-vectors are not binary vectors and they are not suitable for direct plant transformation. In addition, most of commercial T-vectors are only to provide multiple cloning sites flanking the insert for subcloning and no GFP gene is present in the T-vectors. Thus, our novel T-vector provides an alternative candidate for facilitating rapid construction of the promoter:: GFP cassette for the reporter gene analysis. Although many pollen-specific genes and their promoters have been identified and characterized as mentioned in the Introduction section, limited data are available on the genome-wide identification of pollen-specific genes. By using Affymetrix microarray rice chips, Wei et al (2010) revealed 25,062 pollen-preferential transcripts by investigating the expression profiles in three vegetative tissues and 5 pollen-related samples 40. Genome-wide expression patterns among seedling, pollens and sperms at anthesis revealed 3,043 pollen-/sperm-specific genes 41. In both cases, only one or three no-pollen tissues were selected for comparative expression analysis. Thus, some pollen-specific genes might be wrongly identified when these genes would be expressed in other vegetative tissues which were not be surveyed. Therefore, pollen-specific genes should be identified by using more vegetative tissues as references for more accurate evaluation. In this study, a total of 1,013 pollen-specific genes were identified by using the MPSS database. These genes were further verified in their expression microarray and RNASeq datasets and 67 highly expressed pollen-specific genes were selected for further analysis (Figures 3 and 4 ). As these pollen-specific genes were initially identified by using the MPSS database, where only the expression data from mature pollens are available, young pollen-specific genes were not included. Thus, more pollen-specific genes with high expression level should be identified if expression data from young pollens are available in the MPSS database. A stage-specific/enriched gene is expressed only in a specific stage or shows significant higher abundance in the stage, for example, in the unicellular stage, of pollen development. The identification of the stage-specific/enriched genes should benefit to better understand the regulatory mechanism of pollen development. Wei et al (2010) identified 2,203 stage-enriched transcripts 40. Another report showed that three transcriptomes of egg cells, sperm cells and pollen vegetative cells are highly divergent and about of those genes were differentially expressed in these cell types 42. Russell et al (2012) also identified 1,668 sperm cell specific genes 41. In this study, among 67 pollen-specific genes, most of them showed expression in the whole pollen development stages with the highest abundance in mature or germinated pollen grains and the expression level in sperms was obviously reduced (Figure 3 ). Our data suggested that most of mature pollen specific genes might play roles not only in mature pollens but also in their tube germination. Previous studies revealed several pollen-specific promoter motifs 43. We have selected 5 motifs for our further discussion. A total of 2,000 bp of promoter region in each promoter was selected to detect the presence of these motifs in the 67 putative pollen-specific promoters. Three of the five motifs, including AGAAA 44. GTGA 20 and AAATGA 24 could be detected in all the 67 promoter sequences. For the remaining two motifs AGGTCA 23 and TGTGGTT 45. 34 and 36 of the promoter sequences contained these two motifs, respectively. Most of these motifs were presented within 1.5 Kb upstream of the start codon of a gene. The data suggested that most of cis - elements to regulate pollen-specific expression should be located 1.5 Kb upstream region of a protein coding gene. Thus, in most of cases, 1.5 Kb of promoter region should be enough to drive pollen-specific expression. Based on the expression patterns of the gene LOCOs10g35930 shown by microarray data, the inconsistence in expression patterns among different microarray datasets was observed. The gene was also expressed in both 02 day old seeds and germinated pollen grains with a detectable signal (Figure 5 B and D ). However, only a very weak signal was observed in sperm cells (Figure 5C ). Our data showed that no GFP signal was detected in these two tissues in the transgenic plants carrying the promoter:: GFP construct (Figures 6 and 7 ), similar to the expression pattern as shown in Figure 5C. The weak inconsistence might be due to the methods used for sample collection in different experiments. On the other hand, promoter activity shown by the reporter GFP gene might be also affected by the promoter sequence length which was used to construct the promoter:: GFP cassette. Materials and Methods Plant materials and growth conditions The japonica rice variety Nipponbare plants ( Oryza sativa L.) were used for all DNA and RNA preparation as well as Agrobacterium - mediated genetic transformation in this study. The rice seeds were germinated in water at 37C for three days and were then planted in pots. All the plants were grown in greenhouse under natural light and temperature conditions. Preparation of DNA and total RNA samples Leaves from two-week old plants were collected and were then frozen in liquid nitrogen for DNA isolation as described by Dellaporta et al (1983) 46. For total RNA isolation, a total of 11 different stages of rice tissues were collected and these tissues were listed as below: (1) two-week old leaves, (2) two-month old leaves, (3) two-week old roots, (4) two-month old roots, (5) 05 cm long panicles, (6) 510 cm long panicles, (7) more than 10 cm long panicles, (8) booting panicles, (9) flowering panicles, (10) milky seeds and (11) mature seeds. Total RNA samples were isolated using a QIAGEN RNeasy Mini kit. The total RNA quality was analysed by Nanodrop reading and only the total RNA samples with A260/A280gt 1.8 were used for further experiments. PCR amplification of bridge fragments from the rice genome for the construction of the T-vector pDsTGFP In order to introduce two Ahd I restriction sites into the pCAMBIA 1300 vector, two DNA fragments were amplified from the rice genome using two primer sets as described in Table S1. One of the fragments (425 bp) matches the region from 77322 nd 77746 th of the rice BAC clone OSJNBb0049H14 and another fragment (900 bp) is from the region 76044 th 76943 rd of the rice PAC clone P0624H09. PCR amplification was carried out in 25 l of reaction mixtures with 50 ng of genomic DNA, 200 M of each of dNTPs, 0.5 M each of primers, 2.5 mM MgCl 2 . 1 unit of DNA Taq polymerase from QIAGEN, and buffer provided by the supplier. The temperature profile started at 94C for 5 min and followed by 30 cycles at 94C for 40 s, 55C65C for 40 s (depending on the Tm value of primers) and 72C for 1 min. The reaction was terminated at 72 for 10 min. After amplification, the two fragments were purified from agarose gel and were then cloned into pGEM-T Easy Vector from Promega. These two fragments were then subcloned into the GFP containing binary vector pCAMBIA 1300 by multiple steps of enzyme digestion and ligation. Expression datasets used in this study for expression verification of pollen-specific genes The MPSS dataset was downloaded from the website mpss. udel. edu/rice/mpssindex 39. Three microarray datasets were downloaded from the GEO datasets 36 (www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/ ) with accession numbers GSE6893, GSE17002 and GSE27988. The RNASeq dataset was downloaded from the MSU rice genome annotation database 47 (rice. plantbiology. msu. edu/index. shtml ). Expression analysis by qRT-PCR The primer sequences used for qRT-PCR were selected by the Applied Biosystems Primer Express software and were listed in Table S1. An eEF-1a gene from the rice genome was used as an internal control to normalize the amplification data. Their primer sequences were also listed in Table S1. A total of 11 RNA samples from different tissues were submitted to the first-strand cDNA synthesis using an Invitrogen kit. The cDNA first strand was used as templates for qRT-PCR analyses. The reactions were carried out using the AB power SYBR Green PCR Master mix kit (Applied Biosystems, P/N 4367659) according to the manufacturers protocol. The threshold cycle (C T ) value was automatically calculated based on the fluorescence of SYBR Green I dye in every cycle, which was monitored by the ABI 7900 system software. The mRNA relative amount was calculated by C T according to our previous description 48. The value was used to evaluate the expression profiling of a gene. The construction of the promoter:: GFP cassette and Agrobacterium - mediated transformation The gene LOCOs10g35930 shows pollen-specific expression and its promoter was selected as an example to construct the promoter:: GFP cassette using the novel T-vector pDsTGFP. A 1,492 bp of promoter fragment was amplified by PCR using the promoter-specific primer set as listed in Table S1. After purification from agarose gel and sequencing verification, the promoter fragment was directly ligated to the T-overhang pDsTGFP. The ligation was then used for transformation into the competent E. coli DH5 cells by the heat-shock method. Plasmid DNA samples were prepared using QIAGEN Plasmid Mini Kit. After verification and orientation by PCR and sequencing, the plasmid DNA was then introduced into Agrobacterium AGL1 by electroporation using GIBCOBRL Cell-Porator. Embryonic calli were induced from mature rice embryos and were used for Agrobacterium - mediated genetic transformation according to the description by Hiei et al (1994) 49 . Fluorescence microscopy for GFP signal detection A Nikon microscope with epifluorescence was used to detect the promoter-driven GFP expression using a B1E filter (excitation 470 to 490 nm, dichronic mirror 515 nm and barrier filter 520 to 560 nm). Photos were taken with the attached digital imaging system. Sequencing of DNA fragments DNA sequencing reactions were performed using the ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit according to the instruction from the supplier. The PTC200 (MJ Research, Inc.) thermocycler was used for temperature profiling according to the ABI cycle sequencing protocol: 25 cycles at 96C for 30 s, 50C for 15 s and 60C for 4 min. The sequencing samples were purified using the Agencourt CleanSEQ sequencing reaction clean-up system (Beckman Coulter) and was then analyzed using an ABI 377 automatic sequencer. Supporting Information Primer sequences used for PCR, sequencing and qRT-PCR. Author Contributions Conceived and designed the experiments: SYJ SR. Performed the experiments: SYJ JV YB. Analyzed the data: SYJ. Contributed reagents/materials/analysis tools: SYJ JV YB. Contributed to the writing of the manuscript: SYJ SR. References 1. Kaufman DL, Evans GA (1990) Restriction endonuclease cleavage at the termini of PCR products. Biotechniques 9: 304306. View Article PubMed/NCBI Google Scholar 2. Clark JM (1988) Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res 16: 96779686. doi: 10.1093/nar/16.20.9677 View Article PubMed/NCBI Google Scholar 3. Holton TA, Graham MW (1991) A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res 19: 1156. doi: 10.1093/nar/19.5.1156 View Article PubMed/NCBI Google Scholar 4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS (1991) Construction of T - vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. 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Thanks for your help Is the Subject Area Pollen applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Polymerase chain reaction applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Rice applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Gene expression applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Panicles applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Microarrays applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Inflorescences applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. Is the Subject Area Genetically modified plants applicable to this article Yes No Thanks for your feedback. A plasmid is an extra-chromosomal element, often a circular DNA. The plasmids we will use in this class typically have three important elements: An origin of replication A selectable marker gene (e. g. resistance to ampicillin) A cloning site (a place to insert foreign DNAs) Since a plasmid is (by definition) an extrachromosomal element, it cannot make use of any origin of DNA replication in a chromosome. That is, DNA synthesis within (i. e. copying of) a plasmid depends on its having an origin of DNA synthesis of its own. Obviously, if a plasmid couldnt be copied, it would be rapidly diluted out in a population of dividing cells because it couldnt be passed on to daughter cells. A selectable marker is not actually a required element of a plasmid, but it makes it possible for us to maintain stocks of cells that contain the plasmid uniformly. Sometimes, carrying a plasmid puts a cell at a selective disadvantage compared to its plasmid-free neighbors, so the cells with plasmids grow more slowly. Cells that happen to quotkick outquot their plasmid during division may be quotrewardedquot by having a higher rate of growth, and so these plasmid-free (sometimes referred to as quot cured quot) cells may take over a population. If a plasmid contains a gene that the cell needs to survive (for example, a gene encoding an enzyme that destroys an antibiotic), then cells that happen to kick out a plasmid are quotpunishedquot (by subsequent death) rather than quotrewardedquot (as in the previous scenario). That selective pressure helps to maintain a plasmid in a population. A cloning site is not required at all, but it sure is nice to have What I mean by quotcloning sitequot is a place where the DNA can be digested by specific restriction enzymes - a point of entry or analysis for genetic engineering work. This is a matter we will be discussing in great detail at a later point. For now, think of the following example: Suppose you are really thirsty and you buy a can of soda. Does it occur to you that one end of the can (the quottopquot) is designed so that you can open it easily If you bought a can of soda with two bottom ends and no top, you would have a hard time drinking it Its the same way with plasmids. You can have a plasmid with lots of terrific features, but you might lack an easy way of quotgetting it openquot with restriction enzymes. Coiling in a plasmid You probably remember that double-stranded DNA has the form of a quotdouble helixquot which looks a bit like a telephone handset cord (except that the telephone cord is a single helix). You may also recall that the double helix is right-handed (for an expose on the difference, take a look at the Left Handed DNA Hall of Fame Site .) Youve probably also noticed how knotted up a telephone cord can get, if your roommate twists the handset around a few times before hanging up. Those knots are a higher order structure that lead to quotcoiled coils. quot DNA has the same problem, though your roommate isnt to blame this time Aside from the double-helical structure that we all know and love, DNA can take on a higher order coiling that twists one double helix around another. We call this quotsuperhelical coilingquot or simply quot supercoiling. quot In a linear molecule these twists can unravel by themselves, provided the ends are not prevented from rotating. In a circular molecule with no free ends, the superhelical twists are quotlocked inquot and the molecule cannot relax. This coiling is not the same as the right-handed double helix coil with which you are all familiar. The supercoiled molecule is a coiled coil. You can click on the image below to see an electron micrograph of a supercoiled circular DNA. Why do we use the word quotvector, quot which weve been trying to forget ever since we took Physics 100 The word has a connotation of taking something from one place to another. A mosquito is said to be a quotvectorquot for malarial parasites, and a velocity quotvectorquot in physics indicates a direction in which an object is travelling. In molecular biology, a quotvectorquot is a piece of DNA that may be introduced into a cell, usually after weve played around with it a bit in a test tube. One important concept is that depending on the cloning strategy employed, a gene could be inserted into the plasmid in either of two orientations: Left to right orientation Right to left orientation Perhaps we dont care which orientation we obtain as our final product, but we should note that there is a fundamental difference between the two. The arrow in the diagram shows the direction of transcription/translation of the quotred genequot coding sequence, and the two orientations differ with respect to the outside markers Amp and ori. How do we clone a plasmid How do we isolate a plasmid we want We introduce the reclosed ( ligated ) products into E. coli, a process called quot transformation quot, and select for bacteria resistant to a drug (such as amipicillin, for example). We screen the individual bacterial colonies to find one that contains a plasmid of the correct structure. Transformation is natural. Bacteria naturally take up DNA from their environment, and we call that process transformation. Efficiency of transformation in the lab. When we are transforming DNA in the laboratory (i. e. for experimental purposes), we have several ways of making the uptake of DNA by E. coli cells more efficient. One method is to starve the cells in ice-cold calcium chloride solution, add a sample of ligated DNA, and quotheat-shockquot the cells at 42 degrees C for a short period of time - about 45 seconds. The fluidity of the membrane increases to the point where DNA is taken up by the cell. A second method is to deliver an electric shock to the cell, releasing a charged capacitor with a field strength in the sample of approximately 1200 volts per millimeter. The DNA is swept into the cells as the membranes are temporarily breached. This process is called electroporation. After transformation, we challenge the bacteria with an antibiotic (such as ampicillin). If the E. coli have taken up and expressed an ampicillin resistance gene on a plasmid, they will live - otherwise they will die. This process is called selection. because we are selecting which bacteria may survive. Transformation is a rare event, so most bacteria in an experiment are killed by the antibiotic. If a bacterium takes up a piece of DNA that cannot be maintained in a cell (e. g. if it lacks an origin of DNA replication ) that cell also will not survive. Its a tough world At this stage we have a bacteriological plate (agar medium containing ampicillin) with bacterial colonies on it. Each colony contains a different plasmid type, because each was grown up from a single transformed cell. What we do now is to isolate DNA from each colony (or a small growth of cells propagated from the colony), and analyze the structure of the plasmid with restriction enzymes or by DNA sequencing. We can use gel electrophoresis to identify the sizes of restriction fragments that are released from the plasmid and to check the purity of the preparation.

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Saturday 12 August 2017

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